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冬虫夏草简介

冬虫夏草主产于我国黔、滇、川、青、藏、等地高原地区的草原草甸之中(草原虫草)和原始森林阴山峡谷土壤之中(森林虫草)。由于草原和原始森林的水土、气侯、日照等生态环境有很大不同,所产虫草在颜色、味道、形态、有所差异。森林虫草产于我国川藏边缘原始森林阴山峡谷土壤之中,是冬虫夏草的珍稀品种。森林虫草通体棕褐色,上好的干品外表可保留着苍黄色菌丝层。草体细长,肉质结实,入口微苦回甘,回味悠长。森林虫草含有的有效成分远比草原虫草高,故其特有的腥、香、苦、甘味道也比草原冬虫夏草更为浓烈。

森林冬虫草活性成分及功效

      本世纪初,在我国横断山脉川、滇、藏边缘地带原始森林阴山峡谷首次发现失传已久了森林冬虫草,其形态、生活习性在古代名中医药书籍中多有记载。失传许久,现重现于世人面前,在中医学界与生物领域都具有重大意义的事件。森林冬虫草新鲜时在幼体表上覆盖有黄绿色菌丝体,如除去黄色菌丝体阴干后虫草为棕褐色,头部为黑褐色,子座常常是单独一枝向上生长,细长扭曲,长4-8cm,直径约0.3cm,上端稍膨大,质柔韧坚实,断面纤维状。有一股自然的菇香味和腥味,并具有味腥、甘、微苦等历史悠久的夏草冬虫入药所必然具有的味道。

      研究工作者对森林冬虫草与草原产冬虫草的主要化学成分包括氨基酸、微生素、微量元素等性味、功效进行比较、研究,结果也基本一致。

      对森林虫草的特殊化学成份进行了科学研究,结果该冬虫草的腺苷、虫草酸含量分别为0.27mg/g和80.2mg/g,明显高于高海拔平原的草甸虫草(0.13mg/g和44.52mg/g),两者的虫草多糖含量也有差别,分别为17.5mg/g和10mg/g(粤微检(2007)FM2482号)。

      科学人员对森林冬虫草进行了急性毒性试验,结果其最大耐受量为69.42g生药/Kg,为临床用药的260.3倍,表明该虫草服用安全性之高。

        对该虫草进行了对免疫作用的研究,表明该虫草对免疫功能具有明显的促进作用(许可证号为SCXK(粤)2003-0002、粤监证字2004A018)。

        森林冬虫草菌丝体(虫草表面金黄色营养膜皮)还具有以下几个方面的药理作用:

1、调节机体的免疫功能

        森林冬虫草菌丝体胞外独有的水溶性虫草多糖不仅能促进人扁桃体及小鼠脾活化T细胞的增殖,而且能恢复环磷酰胺抑制免疫小鼠脾活化T细胞的增殖;它能增高小鼠脾细胞NK及分泌IL22,也能增进人的扁桃体活化T细胞分泌TNF ;它还能调节巨噬细胞的吞噬活性,这说明森林冬虫草具有增强细胞的免疫功能及抗病能力。

2、抗辐射作用

        森林冬虫草菌丝体水提物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌抗紫外线辐射有一定的保护作用,提示了该虫草在作为抗辐射用品方面有很好的应用前景。

3、辅助肿瘤的放射治疗,提高机体在辐射后的抗感染能力

        森林冬虫草菌丝体水提物在所试剂量下均能提高辐射损伤小鼠脾细胞产生抗SRBC抗体的能力和小鼠血清溶血素的水平,表明该物质能提高辐射损伤小鼠的体液免疫功能;该虫草菌丝体水提物在所试剂量下均能提高辐射损伤小鼠脾T淋巴细胞的增殖能力和小鼠脾B淋巴细胞增殖水平,说明其能促进和改善辐射损伤小鼠的淋巴细胞功能状态;该虫草菌丝体水提物在所试较高剂量和较低剂量下都能提高辐射损伤小鼠脾淋巴细胞ADCC活性。

        由于电离辐射对机体的的生殖系统、造血系统和免疫系统能产生严重损害,表现为受照射后生殖细胞畸型,粒细胞减少和免疫功能低下;肿瘤的放射治疗是杀伤肿瘤细胞的有效方法之一,但同时也损害了肿瘤患者的免疫功能,引起严重的继发性条件致病菌感染。因此森林冬虫草能够辅助肿瘤的放射治疗,恢复和提高机体放射后的免疫功能。

4、明显的抗菌作用

        森林冬虫草菌丝体的乙醚浸提液对革兰氏阳性菌如黄色葡萄球菌、枯草杆菌有明显的抑制作用;乙醇提取液对大肠杆菌和变形杆菌有明显的抑制作用,这些结果都提示了该虫草具有很好的抗菌消炎效果。

        此外,通过的广泛使用,森林冬虫草的功效主要表现在滋阴补肾、强身健体、抗衰老、抗疲劳、改善睡眠、抗菌消炎、祛痰平喘、降血压、降血糖、去邪扶正等。因此许多人喜欢用该虫草炖鸡、鸭、瘦肉、水鱼等,用以治疗腰膝酸痛、神经衰弱、病后久虚、哮喘咳嗽、高血压、糖尿病及多种炎症虚症及男女肾功能疾病。


森林冬虫草治疗白血病的研究

森林冬虫草治疗白血病的研究

       白血病是造血系统的恶性肿瘤,治疗方法包括联合化疗、放射治疗、免疫治疗或骨髓移植等,这些治疗方法或在杀伤肿瘤细胞的同时,也损伤了机体正常细胞,或费用昂贵,所以研究抑制白血病细胞增殖或诱导其向正常成熟细胞分化的药物,成为治疗研究的热点。研究表明,白血病细胞K562细胞可在不同的分化诱导剂作用下分别向巨核细胞系,红细胞系及巨噬细胞系分化5-7白血病细胞HL-60细胞在分化诱导剂的作用下能向中性粒细胞及单核细胞分化8-9。森林冬虫草是一种冬虫草新种,含有冬虫草稀有的水溶生虫草多糖。我们对森林冬虫草抗生素及其胞外水溶性虫草多糖(CDP)进行研究,证明它们有清除自由基和抗辐射、抗癌的作用及免疫调节能力。基于森林冬虫草胞外水溶性虫草多糖CDP的抗癌、抗辐射及免疫调节等作用,本研究探讨CDP对白血病细胞K562HL-60的诱导分化作用,旨在为临床用药提供实验依据。

1材料和方法

1.1材料

        RPMI1640购于GIBCO公司,森林冬虫草水溶性多糖CDP由野生森林冬虫草提取、鉴定,Nikon倒置荧光显微(TE2000-U)及摄影系统,LD4-2A型低速离心机。

1.2方法

1.2.1 K562细胞诱导分化 将人红白血病K562慢性髓细胞白血病细胞悬浮于完全RPMI640培养基中,内含10%新生小牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素,在37℃、5%CO2培养箱中传代培养。将生长良好的细胞制成6×105/ml细胞悬液,接种于24孔板中,每孔1ml,每平行3孔为1组,分别加1ml不同浓度的诱导分化剂(CDP终浓度分别为1mg/L10 mg/L100 mg/L1000 mg/L),阳性对照加2%的二甲亚砜(DMSO)1ml,阴性对照加RPMI1640 1ml,置于37℃、5% CO2培养箱中2d后,每组取少量细胞悬液(50μL)用台盼蓝染色法计数死活细胞数,剩余细胞悬液(1950μL)离心10min,取细胞沉淀20μL,加血红蛋白转化液(文齐氏液)5ml,转化5min,于血红蛋白仪上测血红蛋白值。

1.2.2 HL-60细胞诱导分化 将人早幼粒白血病HL-60细胞悬浮于完全RPMI1640培养基中,内含10%新生小牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素,在37℃、5%CO2培养箱中传代培养。将生长良好的细胞制成2×105/ml细胞悬液,接种于24孔板中,每孔1ml,每平行3孔为1组,分别加1ml不同浓度的诱导分化剂(CDP终浓度分别为1mg/L10 mg/L100 mg/L1000 mg/L),阴性对照加RPMI1640 1ml,置于37℃、5% CO2培养箱中作用2d后,同法离心,取细胞沉淀涂片,迅速风干,瑞氏染色,显微镜计数200个细胞,观察细胞分化程度。

1.3 判断指标

        柑橘每孔活K562细胞数、死K562细胞数计算细胞存活率【细胞存活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%】,根据血红蛋白仪检测值计算每106K562细胞所含血红蛋白量,根据分类计数结果计算HL-60细胞分化率。

1.4 统计学分析

        采用SPSS13.0软件进行数据统计分析。实验数据以x± s表示,实验组与对照组用Dunnett-t检验,组间比较采用单因素方差分析,P0.05有统计学意义。

2结果

2.1 CDPK562细胞存活率及血红蛋白含量的影响

        台盼蓝染色观察K562细胞,随着诱导分化剂(森林冬虫草水溶性多糖CDP浓度的增高,细胞存活率逐渐增高,细胞内血红蛋白含量也逐渐增加,其含量可达到阴性对照的2倍,阳性对照的1.6倍,见表1

2.2 CDPHL-60细胞形态学的影响

        在液体培养基条件下HL-60细胞多为原始细胞,呈圆形或椭圆形,大小不一,核为圆形或椭圆形,核染色质疏松细致,核浆比例大,几乎没有分化细胞。经CDP处理后,细胞形态学上趋于分化成熟,表现为胞浆增多,核浆比变少,核仁减少或消失,核染色质变粗糙,有空泡,呈网状,细胞核出现肾形,马蹄形。见图1.分化细胞百分率增加,见表2

讨论

        细胞分化成熟障碍是肿瘤发生的主要机制,诱导肿瘤细胞分化是治疗肿瘤的关键。诱导肿瘤细胞分化的特点是不杀伤肿瘤细胞,而是诱导肿瘤细胞分化为正常或接近正常细胞。细胞的分化表现在形态和功能两方面,形态分化是细胞分化的重要标志之一,它能客观地反映诱导分化剂对细胞诱导分化的作用。

        人红白血病K562细胞是Lozzio10从慢性髓细胞性白血病患者的胸膜渗出液中分离培养建立起来的白血病细胞系,其在四氮唑蓝(NBT),六亚甲基二乙酰胺(HMBA)及羟基脲的诱导下可分别向巨核细胞系,单核细胞系及红细胞系分化5-7,是当今研究诱导白血病细胞分化及探讨其分化机制的理想细胞模型。K562细胞丧失分化的能力及在不同诱导剂作用下可向不同细胞系分化的分子机制仍不十分清楚。本研究显示,经不同浓度CDP作用2d后的K562细胞趋于成熟,表现为CDP处理组细胞血红蛋白含量较阴性对照组含量增加,且细胞存活率随CDP浓度增加而升高,这些结果提示,CDP有诱导K562细胞分化成熟的作用。有研究证明,HL-60细胞在诱导剂的作用下能向中性粒细胞及单核细胞分化,分化细胞包括中幼粒细胞、晚幼粒细胞、杆状核粒细胞及分叶核粒细胞8-9。一般说阴性对照组的早幼粒细胞应在90%以上,诱导分化剂处理组细胞分化成熟程度越高,晚幼粒细胞、杆状核粒细胞及分叶核粒细胞所占比例越大,说明该诱导分化剂的效果越好。本研究显示,经不同浓度CDP作用2天后的HL-60细胞在形态学上有不同程度的趋于成熟细胞的表现,如胞浆增多,核浆比变小,核仁减小或消失,核染色质变粗,又空泡,呈网状,细胞核出现肾形、马蹄形。结果显示,CDP有诱导HHL-60细胞分化的作用。

        本实验研究表明,森林冬虫草水溶性多糖CDP1000mg/L)不但可显著诱导人红白血病慢性髓细胞白血病K562细胞向红细胞分化,而且也可以诱导人早幼粒白血病HL-60细胞向粒细胞分化,其原理有待进一步研究。

参考文献

【1】 焦彦朝,梁宗琦,刘爱英。虫草生物活性物质研究概况。贵州农业科学,19903):53

【2】 梁宗琦,刘爱英,刘杰麟。虫草一新种及其绿僵菌无性型。真菌学报,19914):257

【3】 Yen A ,et al ,12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA) and staurosporine induce retinoblastoma tumor suppressor gene expression with megakaryocytic differentiation of leukemiccells[J]. Cancer Res,1993(53):3085-3091.

【4】 Lampronti I , et al. Accumulation of gamma-globin mRNA in human erythroid cells treated with angelicin [J].Eur J Haematol,2003(3):189-195.

【5】 王振义,陈竺,肿瘤的诱导分化和凋亡疗法。上海:上海科技出版社,1989:32-33.

【6】 王志红,林著。小聚碱对HL-60细胞诱导分化及增殖抑制的作用。福建医科大学学报,20042:135-138


森林冬虫草治疗癌症的研究

        由于森林冬虫草发现较晚,对其研究很不深入。我们研究了森林冬虫草中生物活性物质对人喉鳞癌细胞(Hep-2)生长抑制与凋亡诱导作用,以及对半胱天冬氨酸蛋白酶-3Caspase-3)活性的影响。发现森林冬虫草中生物活性物质在体外能显著地抑制Hep-2的细胞生长,抑瘤率高达57.5%。而抑制细胞生长的主要效应机制是直接启动发生细胞凋亡而不是诱发坏死,并且是通过激活Caspase-3促使细胞凋亡。这对治疗人喉癌具有重大意义。

      近年来,细胞凋亡的分子机制的研究证明多种基因产物参与细胞凋亡过程,人们提出了细胞凋亡2条主要信号传导通路2:细胞凋亡的线粒体依赖途径和死亡受体途径,认为半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)是凋亡机制中上述2条信号传导通路中重要的效应因子。细胞在经历凋亡时,半胱天冬氨酸蛋白酶-3Caspase-3)作为凋亡途径主要的下游执行者而被激活。实验过程如下。

材料与方法

材料①森林冬虫草中活性物质提取:森林冬虫草采自川藏原始森林,经理化性质初步分析为多糖类物质(水溶性虫草多糖CDP-1)。②肿瘤细胞株:Hep-2。③试剂:RPMI-1640培养液(美国GIBCO公司);MTT、丫啶橙、溴化乙锭(美国Sigma公司);SDS(天津试剂公司日本进口分装);噻替哌(上海旭东海普药业有限公司)ApoAlertTMCaspase-3活性测定试剂盒(Biosciences Ckontech公司)。④仪器:全自动酶标仪(BIO-RAD550);荧光显微镜(OLYMPUSBX60;流式细胞仪(BECTION DICKINSON;9624孔细胞培养板购于华美公司(美国进口);CO2培养箱。

方法1)对Hep-2细胞的抑制作用:MTT法,取对数生长期的Hep-2细胞(1×105.ml-1),100μL/孔加入96孔细胞培养板中,同时加入一定浓度的D1101001000μg.ml-1),并设置PRMI1640完全培养基阴性对照、噻替哌阳性对照(终浓度为10μg.ml-1),375% CO2培养4h,加入20%SDS溶解细胞,待细胞完全溶解后,用全自动酶标仪检测每孔OD值(测定波长550nm、参比波长630nm3。报告OD值计算公式:OD=OD550-OD630。(2)细胞凋亡检测:流式细胞光度术检测法4,取对数生长期的Hep-2细胞(1×105.ml-1),加入一定浓度的D1101001000μg.ml-1),并设置RPMI1640完全培养基阴性对照、噻替哌阳性对照,375% CO2培养箱中培养48h后,用0.01molml-1PBS(PH7.4)洗涤3次,使得细胞浓度不低于1×105.ml-1,加入溴乙锭(终浓度为50mg.L-1),4℃避光放置,染色30min后用流式细胞仪进行检测,用激光(488nm)或蓝光(BG12滤光镜)激发后检测红色荧光,红色荧光的强弱反映细胞内DNA的含量。(3Caspase-3活性测定,D作用于Hep-2细胞122448h,每个时间段设3组:分别为①对照组、②D作用组(10μg.ml-1)、③D作用(10μg.ml-1+ Caspase抑制剂(DEVD-fmk)组。按Caspase-3活性测定试剂盒说明书操作。

结果

1 DHep-2细胞株生长的抑制作用见表1

2Hep-2细胞发生细胞凋亡的影响见表2

3 Hep-2细胞经D作用后Caspase-3活性状况见附图。

讨论

        细胞凋亡是一种受控于基因指导的主动性细胞自我消亡过程,具有与细胞坏死迥然不同的形态与生化特征56。本研究采用MTT法发现:森林冬虫草中生物活性物质在体外能显著地抑制Hep-2的细胞生长,抑瘤率高达57.5%。当细胞发生细胞凋亡时,由于内源性核酸内切酶激活使DNA广泛降解、断裂、随着细胞凋亡的进展,DNA断裂产生的小分子量的DNA溢出细胞外,细胞内的总DNA量降低。在进行流式细胞仪检测发生了细胞凋亡的标本时,在正常G0/G1细胞群前会出现一DNA低染细胞群,称为“亚G1细胞群”或“A0细胞群”,即为凋亡细胞群[7]

       在进行Hep-2细胞体外细胞凋亡实验中证实:森林冬虫草生物活性物质体外能很好的诱导Hep-2细胞发生细胞凋亡,细胞凋亡率高达38.57%,故推测森林冬虫草中生物活性物质体外抑制Hep-2细胞生长的主要效应机制是直接启动Hep-2发生细胞凋亡而不是诱发坏死。Caspase是一组天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶,其家族成员达14种以上,其中至少2/3Caspase与细胞凋亡相关并参与多种与凋亡有关的机体生理性或病理性过程7。在凋亡发生时,Caspase家族成员往往以酶原形式存在,裂解为Mr[(17~20)×103]Mr[(10~12)×103]活化片段。该组蛋白酶的级联活化是细胞凋亡的主要运行方式,他们在凋亡反应的起始阶段、效应阶段和降解阶段中均起主要作用,其中反应链上游的Caspase-8Caspase-9Caspase-3最为重要。而Caspase-3在细胞中是以无活性的酶原形式存在,活化的Caspase-3能促进凋亡信号的传导8

       研究结果证实:Caspase-3活性在森林冬虫草生物活性物质作用早期就有升高,在作用12h达到峰值,此时开始引起Hep-2细胞凋亡。进一步证实森林冬虫草生物活性物质能诱导Hep-2细胞凋亡,并且是通过激活Caspase-3促使细胞凋亡。

       综上所述,森林冬虫草中生物活性物质在体外能显著的抑制Hep-2细胞的生长,而抑制细胞生长的主要效应机制是直接启动发生细胞凋亡而不是诱发坏死,并且是通过激活Caspase-3促使细胞凋亡。

参考文献

【1】 梁宗琦,刘爱英,刘杰麟。虫草一新种及其绿僵菌无性型。真菌学报,1991103):172

【2】 Desagher S ,Martinou JC. Mitochondria as the central contral xontrol point of apoptosis. Trends Cell Biol,2000;10(9):368.

【3】 付体辉,谢之荣,邓碧芳,等。MTT比色法检测肿瘤患者的淋转功能及其条件分析。中国实验临床免疫学杂志,199462:30

【4】 赵卫红,寿好长主编。细胞凋亡。郑州:河南医科大学出版社,1997:58

【5】 Jonstone RW,Ruefi AA, Lowe SW. A link between cancer genetics and chemotherapy . CELL ,2002;108(2):153.

【6】 Ehlert JE ,Kubbutat MH. Apoptosis and its relevance in cancer therapy.Onkologie,2001;24(5)433.

【7】 Fan XQFuo YJ. Apoptosis in oncology . Cell Res,2001;11(1):1.

【8】 Abu-Qare AW, Abou-Donia MB . Biomarkers of apoptosis : release of cytochrome c , activation of caspase-3 , induction of 8-hydroxy-2 ‘-de-oxyguanosine , increased 3-nitrotyrosine , and alteration of p53 gene . J Toxicol Environ Health B Crit Rev,2001;4(3):313.


森林冬虫草有效成分分析

        冬虫夏草按产地不同有草原虫草和森林虫草之分,两者的微观形态和宏观形态均有差别。为了解两者有效成份含量,为临床使用提供参考,我们对森林虫草与草原虫草从部分化学成分进行比较研究,结果两者的氨基酸、维生素、微量元素等成分基本一致,定性试验表明两者均含有生物碱、甾醇、虫草素成分。

一、 实验方法

1、氨基酸测定:

        水解氨基酸测定的对比分析分别称取0.2g草原虫草和森林虫草干粉末,加酸水解,过滤、洗涤、定容,然后10μl35μl衍生化试剂,混匀,取10μl进样。用岛津LC-3A高效液相色普仪测定,分析结果列于表1

        从表1水解氨基酸含量,可看出两者均含有八种人体必需氨基酸,且氨基酸种类相同,除森林虫草谷氨酸含量是草原虫草501倍外,其余氨基酸含量也均是草原虫草2.5~23倍。

2、维生素测定

        维生素测定的对比分析水溶性维生素测定的对比分析:分别称取1g草原虫草和森林虫草粉末,用KCI水解提取、洗涤、过滤、定容,各取10μl分别注入LC-3A高效液相色普仪,用Cb柱分离、洗脱,SPD-1紫外检测器测定,测试结果列于表2

        草原虫草与森林虫草所含水溶性维生素的种类相同,含量互有高低。

       脂溶性维生素测定的对比分析:分别称取1g草原虫草和森林虫草粉末,用百分之八十乙醇提取,然后按水溶性维生素测定方法测定,测试结果列于表2

      草原虫草与森林虫草均含维生素A; 草原虫草未检出维生素E, 而森林虫草却含维生素E2166.12mg/100mg)

3、生物碱和甾醇

        生物碱和醇成分的对比分析 按文献的成分预试方法,两者均呈阳性反应。

        冬虫夏草素的定色反应 红紫酸胺反应:取森林虫草粉末和草原虫草粉末的乙醇提取液2mI分别置于试管中,分别加入3~5滴氨水,两者均呈红紫色。说明两者均含冬虫夏草素。

4、微量元素:

几种微量元素测定对比 分别将两种虫草经90摄氏度干燥恒重,精密称量,湿化硝化后,用岛津AA--370原子吸收仪测定ZnCuMnFeCoCr的含量,结果见表3

森林虫草ZnMnSe元素含量高于草原虫草。有利于补肾阳、抗癌,延缦衰老作用。

二 小结

从本实验结果看,两者的氨基酸、维生素、微量元素等成分各有差别,森林虫草在某些重要有效成分含量更高一些。

参考文献

1孙云汉,冬虫夏草及人工虫草菌丝研究概况。中药通报, 198710(13)]

张淑兰,冬虫夏草及人工虫草菌丝抗小鼠Lewis肿瘤的研究,中药通报,1987,12(2):53

中国医学科学院药物局,虫草药效成分的研究(第一册)。北京,人民卫生出版社,


森林冬虫草珍稀虫草多糖研究

        虫草多糖由于其抗肿瘤作用、抗辐射作用和免疫调节作用,对人和动物无毒无害,对治疗肿瘤和感染所引起的免疫抑制有巨大的价值贡献。但迄今为止,所发现的虫草多糖多为胞内多糖,即是胞外多糖也是水不溶性的,增大了人体吸收的难度。因此,寻找生产免疫活性的水溶性胞外多糖的虫草新种,探讨生产虫草多糖和菌丝体的最佳条件就显得非常迫切和需要。本文对川藏森林冬虫夏草所含虫草多糖(CDP)的免疫调节作用,组成及液体培养条件进行了研究。

        研究结果表明:森林冬虫夏草所含虫草多糖CDP为水溶性胞外多糖,不像其它人工培植虫草胞外多糖不溶于水而致人体难以吸收。草原冬虫夏草含有两种虫草胞内多糖CT-4NCS-1,其产率分别为0.08%0.77%。而森林冬虫夏草的水溶性虫草多糖CDP粗糖产量为16.75g/l,纯多糖产量也较高可达13.5g/l,明显高于上述几种多糖。实验中还论证了森林冬虫夏草所含虫草多糖CDP的具有免疫作用。

        首次发现森林冬虫夏草含有虫草类中稀见的脂溶性抗生素。因此脂溶性抗生素和CDP可望得到综合利用。

       森林冬虫夏草的服用安全性也得到论证。

下面为实验过程和方法:

1】材料和方法

1.1菌种提取自川藏森林野生冬虫夏草。

1.2 培养基

1.2.1沙氏培养液(Sabourauds Broth:葡萄糖40g,蛋白胨10g,水1000ml

1.2.2马铃薯葡萄糖培养液(PDA:取去皮马铃薯200g,切成小块,加水1L,煮30分钟,纱布过滤,滤液中加葡萄糖20g,最终体积至1000ml

1.2.3察氏培养液(CZ:蔗糖30gNaNO33gK2HPO41gMgSO4.7 H2O0.5gKCl0.5gFeSO0.01g,蒸馏水1000ml

1.2.4AM培养液:可溶性淀粉20g,葡萄糖20g,棉子粉4g,蛋白胨4g,土豆粉4gMgSO4.7 H2O0.4gCaCO34g,蒸馏水1000mlpH6.0

1.2.5黄豆粉葡萄糖培养液(SGM):葡萄糖30g,黄豆粉5g,酵母膏2gK2HPO41gMgSO4.7 H2O0.5g,蒸馏水1000ml

1.2.6完全培养液(CM:葡萄糖40g,蛋白胨10g,酵母膏5g,蒸馏水1000ml

1.3方法

1.3.1淋巴细胞转化实验:参阅林学颜(1980)方法。

1.3.2菌丝产量测定:按俞大绂等(1985)方法。

1.3.3多糖的提取:参阅李兆兰(1987)方法。

1.3.4粗多糖重量的测定:取烘干恒重的粗多糖粉末放在电光分析天平上称重。

1.3.5粗多糖纯度的测定:采用蒽酮硫酸法。具体操作参阅张惟杰(1987)的方法。

1.3.6纸层析:用新华1滤纸(24×10cm),乙酸乙酯-吡啶-水(10:4:3)为展开剂(吴梧桐等,1984)。显色剂为苯胺-磷酸试剂,4g二苯胺,4ml苯胺及20ml85%磷酸溶于20ml丙酮(张惟杰1987)标注品与样品含量均为10mg/ml左右。

1.3.7培养方法

静置培养:25℃恒温培养24天。200ml三角瓶100ml培养液,接种量5ml100ml三角瓶装20ml培养液,接种量0.5ml

振荡培养:24~26℃,振床转速100~110r/min200ml三角瓶装去100ml,接种量5ml4个重复。与多糖有关的实验中,7~8个重复,多糖是7~8瓶所含的多糖之和,折合成每升培养液所产生多糖的量。生物量取4个最接近的数值平均值。

数据处理:仪器为CASIOfx-3600p函数计算器。采用LSR法。

2】实验结果

2.1森林冬虫夏草水溶性胞外多糖(CDP)对淋巴细胞转化的影响

       本试验所用森林冬虫夏草水溶性胞外多糖(CDP)粗品用SGM培养液生产,纯度为80%CDP转化率比对照增加16.2倍,说明CDP有促进淋巴细胞转化作用,但与PHA合用无协同作用。该种情况在用银耳子实体多糖(TF)所做的淋巴细胞转化实验中也出现,说明不是偶然现象。

2.2森林冬虫夏草水溶性胞外多糖(CDP)的分离纯化及组成单糖的鉴定。

      取森林冬虫夏草水溶性胞外多糖(CDP)粗品干粉3g,溶于30ml热水中,离心除去不溶物,用Sevag方法除蛋白,干燥备用。取0.1g脱蛋白多糖,经Sephadex G-200柱(2×60cm)分离,洗脱液为0.1M NaCl,流速为0.25ml/min,分管收集,每管3ml,蒽酮法检测。洗脱曲线见图1,由此图可知仅有一个峰,说明CDP只有一个组分,利用分子排阻法推测其分子量200,000左右。

        合并含糖量高的洗脱液25ml透析至无Cl-为止,然后用PEG6000浓缩至1ml,加入5ml2N硫酸,封安瓿80℃水解24小时,取出用BaCO3中和,过滤除去BaSO 4沉淀,即得多糖的水解产物。点样进行纸层析,结果见图2。从左至右以此为山梨糖、鼠李糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、CDP水解液,其Rf值分别为0.290.540.410.20.230.23,说明CDP水解产物为葡萄糖组成,CDP为一种葡萄聚糖分子。

森林冬虫夏草水溶性胞外多糖(CDP)对全血淋巴细胞转化的影响

2.3温度对森林冬虫夏草菌种生长的影响

       不同温度对虫草菌丝产量的影响很大。森林冬虫夏草菌株生长的最是温度范围为25~29℃。当温度上升到37℃时,未测出菌丝干重,经镜检分生孢子没萌发,此温度为菌丝生长的极限温度。

2.4培养基对虫草的菌丝产量和胞外多糖产量的影响

        不同培养基处理对菌丝产量和胞外多糖产量影响很大。由图5可知,菌丝产量最高的培养基为SGM,达到1.24/100ml。其次为CM,是最高产量的80%AMSab相差不大,产量最低的为PDACZ培养基。

        由图6可知,多糖产量最高的培养基也是SGM,纯多糖产量可达13.54g/l(粗多糖产量为6.75g/l)。其次为CM,只是最高产量的14%,其后以此为AMSabPDACZCZ几乎不产多糖,只有0.03g/l是最高产量的0.2%。由此可见,最有利菌丝和多糖生产的培养基为SGM

3】分析和讨论

        淋巴细胞转换试验表明森林冬虫夏草水溶性胞外多糖(CDP)有促进淋巴细胞转换作用,说明CDP具有免疫调节作用。而且CDP为水溶性胞外多糖,不像其它虫草胞外多糖不溶于水而增加了人体吸收的难度。草原冬虫夏草含有两种虫草胞内多糖CT-4N(Kino,et al1986)CS-1(Miyazaki,et al,1977),其产率为别为0.08%0.77%,即是研究较多的裂褶菌多糖,胞外粗多糖产量只有5.37g/l,纯多糖产量只有2.15g/l(李兆兰,1987)。而森林冬虫夏草的水溶性虫草多糖CDP粗糖产量为16.75g/l,纯多糖产量也较高可达13.5g/l,明显高于上述几种多糖。菌丝产量也较高达到1.24g/100ml

        此外,森林冬虫夏草含有首次在虫草无性型中所发现的脂溶性抗生素。因此脂溶性抗生素和CDP可望得到综合利用。

        森林冬虫夏草菌种在37℃时分生孢子不能萌发,菌丝不能生长。人的正常体温为36.5~37.5℃,各种家畜、家禽的温度更高,森林冬虫草菌种不可能在此温度下生长。因此,森林冬虫夏草服用对人、家畜、家禽是安全的。

参考文献

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张惟杰主编。复合多糖生化研究技术。上海:上海科技出版社,1987:1~21

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Miyazaki J et al .studies on fungal polysaccharides.X X Galactomann of Cordyceps sinensis Chem pharm Bull,1977,25(12):3324~3328

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