虫草多糖由于其抗肿瘤作用、抗辐射作用和免疫调节作用，对人和动物无毒无害，对治疗肿瘤和感染所引起的免疫抑制有巨大的价值贡献。但迄今为止，所发现的虫草多糖多为胞内多糖，即是胞外多糖也是水不溶性的，增大了人体吸收的难度。因此，寻找生产免疫活性的水溶性胞外多糖的虫草新种，探讨生产虫草多糖和菌丝体的最佳条件就显得非常迫切和需要。本文对川藏森林冬虫夏草所含虫草多糖（CDP）的免疫调节作用，组成及液体培养条件进行了研究。

        研究结果表明：森林冬虫夏草所含虫草多糖CDP为水溶性胞外多糖，不像其它人工培植虫草胞外多糖不溶于水而致人体难以吸收。草原冬虫夏草含有两种虫草胞内多糖CT-4N和CS-1，其产率分别为0.08%和0.77%。而森林冬虫夏草的水溶性虫草多糖CDP粗糖产量为16.75g/l，纯多糖产量也较高可达13.5g/l，明显高于上述几种多糖。实验中还论证了森林冬虫夏草所含虫草多糖CDP的具有免疫作用。

        首次发现森林冬虫夏草含有虫草类中稀见的脂溶性抗生素。因此脂溶性抗生素和CDP可望得到综合利用。

       森林冬虫夏草的服用安全性也得到论证。

下面为实验过程和方法：

【1】材料和方法

1.1菌种提取自川藏森林野生冬虫夏草。

1.2 培养基

1.2.1沙氏培养液（Sabouraud‘s Broth）:葡萄糖40g，蛋白胨10g，水1000ml。

1.2.2马铃薯葡萄糖培养液（PDA）:取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1L，煮30分钟，纱布过滤，滤液中加葡萄糖20g，最终体积至1000ml。

1.2.3察氏培养液（CZ）:蔗糖30g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4.7 H2O0.5g，KCl0.5g，FeSO4 0.01g，蒸馏水1000ml。

1.2.4AM培养液：可溶性淀粉20g，葡萄糖20g，棉子粉4g，蛋白胨4g，土豆粉4g，MgSO4.7 H2O0.4g，CaCO34g，蒸馏水1000ml，pH6.0。

1.2.5黄豆粉葡萄糖培养液（SGM）：葡萄糖30g，黄豆粉5g，酵母膏2g，K2HPO41g，MgSO4.7 H2O0.5g，蒸馏水1000ml。

1.2.6完全培养液（CM）:葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母膏5g，蒸馏水1000ml。

1.3方法

1.3.1淋巴细胞转化实验：参阅林学颜（1980）方法。

1.3.2菌丝产量测定：按俞大绂等（1985）方法。

1.3.3多糖的提取：参阅李兆兰（1987）方法。

1.3.4粗多糖重量的测定：取烘干恒重的粗多糖粉末放在电光分析天平上称重。

1.3.5粗多糖纯度的测定：采用蒽酮—硫酸法。具体操作参阅张惟杰（1987）的方法。

1.3.6纸层析：用新华1滤纸（24×10cm），乙酸乙酯-吡啶-水（10:4:3）为展开剂（吴梧桐等，1984）。显色剂为苯胺-磷酸试剂，4g二苯胺，4ml苯胺及20ml85%磷酸溶于20ml丙酮（张惟杰1987）标注品与样品含量均为10mg/ml左右。

1.3.7培养方法

静置培养：25℃恒温培养24天。200ml三角瓶100ml培养液，接种量5ml。100ml三角瓶装20ml培养液，接种量0.5ml。

振荡培养：24~26℃，振床转速100~110r/min200ml三角瓶装去100ml，接种量5ml，4个重复。与多糖有关的实验中，7~8个重复，多糖是7~8瓶所含的多糖之和，折合成每升培养液所产生多糖的量。生物量取4个最接近的数值平均值。

数据处理：仪器为CASIOfx-3600p函数计算器。采用LSR法。

【2】实验结果

2.1森林冬虫夏草水溶性胞外多糖（CDP）对淋巴细胞转化的影响

       本试验所用森林冬虫夏草水溶性胞外多糖（CDP）粗品用SGM培养液生产，纯度为80%。CDP转化率比对照增加16.2倍，说明CDP有促进淋巴细胞转化作用，但与PHA合用无协同作用。该种情况在用银耳子实体多糖（TF）所做的淋巴细胞转化实验中也出现，说明不是偶然现象。

2.2森林冬虫夏草水溶性胞外多糖（CDP）的分离纯化及组成单糖的鉴定。

      取森林冬虫夏草水溶性胞外多糖（CDP）粗品干粉3g,溶于30ml热水中，离心除去不溶物，用Sevag方法除蛋白，干燥备用。取0.1g脱蛋白多糖，经Sephadex G-200柱（2×60cm）分离，洗脱液为0.1M NaCl,流速为0.25ml/min，分管收集，每管3ml，蒽酮法检测。洗脱曲线见图1,由此图可知仅有一个峰，说明CDP只有一个组分，利用分子排阻法推测其分子量200,000左右。

        合并含糖量高的洗脱液25ml透析至无Cl-为止，然后用PEG6000浓缩至1ml，加入5ml2N硫酸，封安瓿80℃水解24小时，取出用BaCO3中和，过滤除去BaSO 4沉淀，即得多糖的水解产物。点样进行纸层析，结果见图2。从左至右以此为山梨糖、鼠李糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、CDP水解液，其Rf值分别为0.29、0.54、0.41、0.2、0.23、0.23，说明CDP水解产物为葡萄糖组成，CDP为一种葡萄聚糖分子。

表1 森林冬虫夏草水溶性胞外多糖（CDP）对全血淋巴细胞转化的影响

2.3温度对森林冬虫夏草菌种生长的影响

       不同温度对虫草菌丝产量的影响很大。森林冬虫夏草菌株生长的最是温度范围为25~29℃。当温度上升到37℃时，未测出菌丝干重，经镜检分生孢子没萌发，此温度为菌丝生长的极限温度。

2.4培养基对虫草的菌丝产量和胞外多糖产量的影响

        不同培养基处理对菌丝产量和胞外多糖产量影响很大。由图5可知，菌丝产量最高的培养基为SGM，达到1.24/100ml。其次为CM，是最高产量的80%，AM和Sab相差不大，产量最低的为PDA和CZ培养基。

        由图6可知，多糖产量最高的培养基也是SGM，纯多糖产量可达13.54g/l（粗多糖产量为6.75g/l）。其次为CM，只是最高产量的14%，其后以此为AM、Sab、PDA、CZ。CZ几乎不产多糖，只有0.03g/l是最高产量的0.2%。由此可见，最有利菌丝和多糖生产的培养基为SGM。

【3】分析和讨论

        淋巴细胞转换试验表明森林冬虫夏草水溶性胞外多糖（CDP）有促进淋巴细胞转换作用，说明CDP具有免疫调节作用。而且CDP为水溶性胞外多糖，不像其它虫草胞外多糖不溶于水而增加了人体吸收的难度。草原冬虫夏草含有两种虫草胞内多糖CT-4N(Kino,et al，1986)和CS-1(Miyazaki,et al,1977)，其产率为别为0.08%和0.77%，即是研究较多的裂褶菌多糖，胞外粗多糖产量只有5.37g/l，纯多糖产量只有2.15g/l(李兆兰，1987)。而森林冬虫夏草的水溶性虫草多糖CDP粗糖产量为16.75g/l，纯多糖产量也较高可达13.5g/l，明显高于上述几种多糖。菌丝产量也较高达到1.24g/100ml。

        此外，森林冬虫夏草含有首次在虫草无性型中所发现的脂溶性抗生素。因此脂溶性抗生素和CDP可望得到综合利用。

        森林冬虫夏草菌种在37℃时分生孢子不能萌发，菌丝不能生长。人的正常体温为36.5~37.5℃，各种家畜、家禽的温度更高，森林冬虫草菌种不可能在此温度下生长。因此，森林冬虫夏草服用对人、家畜、家禽是安全的。

参考文献

1 焦彦朝等。虫草生物活性物质研究概况。贵州农业科学，1990，（3）:53~58

2 李兆兰。裂褶菌深层培养及多糖测定。真菌学报，1987,6（3）170~177

3 梁宗琦，刘爱英等。虫草一新种及其绿僵菌无性型。真菌学报，1991,10（3）：172~180

4 林学颜编，免疫学基础。福州，福建科技出版社，1980:184~187

5 吴梧桐等。银耳孢子多糖TF-A、TF-B、TF-C的分离、纯化及组成单糖的鉴定。生物物理与生物化学学报，1984,16（4）：393~398

6 俞大绂，李季伦编。微生物学（第二版）。北京：科学出版社，1985：682~690

7 张惟杰主编。复合多糖生化研究技术。上海：上海科技出版社，1987:1~21

8 Kino T et al. A minor protein-containing galactomannan from a sodium carbonate extract of Cordyceps sinensis, Carbonhydr Res,1986,155:189~197

9 Miyazaki J et al .studies on fungal polysaccharides.X X Galactomann of Cordyceps sinensis Chem pharm Bull,1977,25(12):3324~3328

10 Toshihiro O et al. Structure of a galactosaminoglycan from C , ophioglossoides. Carbonbydr Res,1984,134(2):275~282·

11 Yamada H et al. Structure and antitumor activity of an ajki-soluble polysaccharide from C. ophioglossoides. Carbonbydr Res,1984,125(1)：107~116