由于森林冬虫草发现较晚，对其研究很不深入。我们研究了森林冬虫草中生物活性物质对人喉鳞癌细胞(Hep-2)生长抑制与凋亡诱导作用，以及对半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性的影响。发现森林冬虫草中生物活性物质在体外能显著地抑制Hep-2的细胞生长，抑瘤率高达57.5%。而抑制细胞生长的主要效应机制是直接启动发生细胞凋亡而不是诱发坏死，并且是通过激活Caspase-3促使细胞凋亡。这对治疗人喉癌具有重大意义。

      近年来，细胞凋亡的分子机制的研究证明多种基因产物参与细胞凋亡过程，人们提出了细胞凋亡2条主要信号传导通路【2】：细胞凋亡的线粒体依赖途径和死亡受体途径，认为半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）是凋亡机制中上述2条信号传导通路中重要的效应因子。细胞在经历凋亡时，半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）作为凋亡途径主要的下游执行者而被激活。实验过程如下。

材料与方法

1 材料①森林冬虫草中活性物质提取：森林冬虫草采自川藏原始森林，经理化性质初步分析为多糖类物质（水溶性虫草多糖CDP-1）。②肿瘤细胞株：Hep-2。③试剂：RPMI-1640培养液（美国GIBCO公司）；MTT、丫啶橙、溴化乙锭（美国Sigma公司）；SDS（天津试剂公司日本进口分装）；噻替哌（上海旭东海普药业有限公司）ApoAlertTMCaspase-3活性测定试剂盒（Biosciences Ckontech公司）。④仪器：全自动酶标仪（BIO-RAD550）；荧光显微镜（OLYMPUSBX60）;流式细胞仪（BECTION DICKINSON）;96、24孔细胞培养板购于华美公司（美国进口）；CO2培养箱。

2 方法（1）对Hep-2细胞的抑制作用：MTT法，取对数生长期的Hep-2细胞（1×105个.ml-1），100μL/孔加入96孔细胞培养板中，同时加入一定浓度的D（1、10、100、1000μg.ml-1），并设置PRMI1640完全培养基阴性对照、噻替哌阳性对照（终浓度为10μg.ml-1），37℃5% CO2培养4h，加入20%SDS溶解细胞，待细胞完全溶解后，用全自动酶标仪检测每孔OD值（测定波长550nm、参比波长630nm）【3】。报告OD值计算公式：OD=OD550-OD630。（2）细胞凋亡检测:流式细胞光度术检测法【4】，取对数生长期的Hep-2细胞（1×105个.ml-1），加入一定浓度的D（1、10、100、1000μg.ml-1），并设置RPMI1640完全培养基阴性对照、噻替哌阳性对照，37℃5% CO2培养箱中培养48h后，用0.01mol•ml-1PBS(PH7.4)洗涤3次，使得细胞浓度不低于1×105个.ml-1，加入溴乙锭（终浓度为50mg.L-1），4℃避光放置，染色30min后用流式细胞仪进行检测，用激光（488nm）或蓝光（BG12滤光镜）激发后检测红色荧光，红色荧光的强弱反映细胞内DNA的含量。（3）Caspase-3活性测定，D作用于Hep-2细胞12、24、48h，每个时间段设3组：分别为①对照组、②D作用组（10μg.ml-1）、③D作用（10μg.ml-1）+ Caspase抑制剂（DEVD-fmk）组。按Caspase-3活性测定试剂盒说明书操作。

结果

1 D对Hep-2细胞株生长的抑制作用见表1。

表2Hep-2细胞发生细胞凋亡的影响见表2。

3 Hep-2细胞经D作用后Caspase-3活性状况见附图。

讨论

        细胞凋亡是一种受控于基因指导的主动性细胞自我消亡过程，具有与细胞坏死迥然不同的形态与生化特征【5、6】。本研究采用MTT法发现：森林冬虫草中生物活性物质在体外能显著地抑制Hep-2的细胞生长，抑瘤率高达57.5%。当细胞发生细胞凋亡时，由于内源性核酸内切酶激活使DNA广泛降解、断裂、随着细胞凋亡的进展，DNA断裂产生的小分子量的DNA溢出细胞外，细胞内的总DNA量降低。在进行流式细胞仪检测发生了细胞凋亡的标本时，在正常G0/G1细胞群前会出现一DNA低染细胞群，称为“亚G1细胞群”或“A0细胞群”，即为凋亡细胞群[7]。

       在进行Hep-2细胞体外细胞凋亡实验中证实：森林冬虫草生物活性物质体外能很好的诱导Hep-2细胞发生细胞凋亡，细胞凋亡率高达38.57%，故推测森林冬虫草中生物活性物质体外抑制Hep-2细胞生长的主要效应机制是直接启动Hep-2发生细胞凋亡而不是诱发坏死。Caspase是一组天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，其家族成员达14种以上，其中至少2/3的Caspase与细胞凋亡相关并参与多种与凋亡有关的机体生理性或病理性过程【7】。在凋亡发生时，Caspase家族成员往往以酶原形式存在，裂解为Mr[(17~20)×103]和Mr[(10~12)×103]活化片段。该组蛋白酶的级联活化是细胞凋亡的主要运行方式，他们在凋亡反应的起始阶段、效应阶段和降解阶段中均起主要作用，其中反应链上游的Caspase-8、Caspase-9与Caspase-3最为重要。而Caspase-3在细胞中是以无活性的酶原形式存在，活化的Caspase-3能促进凋亡信号的传导【8】。

       研究结果证实：Caspase-3活性在森林冬虫草生物活性物质作用早期就有升高，在作用12h达到峰值，此时开始引起Hep-2细胞凋亡。进一步证实森林冬虫草生物活性物质能诱导Hep-2细胞凋亡，并且是通过激活Caspase-3促使细胞凋亡。

       综上所述，森林冬虫草中生物活性物质在体外能显著的抑制Hep-2细胞的生长，而抑制细胞生长的主要效应机制是直接启动发生细胞凋亡而不是诱发坏死，并且是通过激活Caspase-3促使细胞凋亡。

参考文献

【1】 梁宗琦，刘爱英，刘杰麟。虫草一新种及其绿僵菌无性型。真菌学报，1991；10（3）：172。

【2】 Desagher S ,Martinou JC. Mitochondria as the central contral xontrol point of apoptosis. Trends Cell Biol,2000;10(9):368.

【3】 付体辉，谢之荣，邓碧芳，等。MTT比色法检测肿瘤患者的淋转功能及其条件分析。中国实验临床免疫学杂志，1994；6（2）:30。

【4】 赵卫红，寿好长主编。细胞凋亡。郑州：河南医科大学出版社，1997:58。

【5】 Jonstone RW,Ruefi AA, Lowe SW. A link between cancer genetics and chemotherapy . CELL ,2002;108(2):153.

【6】 Ehlert JE ,Kubbutat MH. Apoptosis and its relevance in cancer therapy.Onkologie,2001;24(5)433.

【7】 Fan XQ，Fuo YJ. Apoptosis in oncology . Cell Res,2001;11(1):1.

【8】 Abu-Qare AW, Abou-Donia MB . Biomarkers of apoptosis : release of cytochrome c , activation of caspase-3 , induction of 8-hydroxy-2 ‘-de-oxyguanosine , increased 3-nitrotyrosine , and alteration of p53 gene . J Toxicol Environ Health B Crit Rev,2001;4(3):313.